SAF的示意圖如圖所示，其中來自13個不同位置的98個樣本跨越11個采樣會話。1。僅采集了地面樣本，因為此次采樣活動沒有可用的飛行硬件。
　　如前所述，需氧細菌孢子負荷為每平方米36個孢子，約占異養可培養細菌總數的20%[23]。對98個樣本中NSA分離株的全長16S rRNA基因進行桑格測序，得到130個分離株，屬于16屬49種（圖2）。97%的這些分離物（126/130）屬于芽孢桿菌、短芽孢桿菌、Cohnella、Graciliabacillus、Oceanobacillus、Paenibacillus，Psychrobacills、Rummelibillus、Sporosarcina、Streptomyces、Terribacillus和Virgibacillus的種類，它們通常被認為是孢子形成菌。芽孢桿菌占該種群的大多數，有73個分離株，屬于21種。NSA培養的剩余約3%的分離物（4/130）是非孢子形成細菌，由黃體短桿菌（Brevibacterium lutolum）、聯合馬西利亞菌（Massilia consociata）、云南微球菌（Micrococcus yunnanensis）和溶血葡萄球菌（Staphylococcus溶血葡萄球菌）組成。當重新測試這些分離物的耐熱性時， 在80℃熱沖擊15分鐘后，它們再次顯示出在電鍍后的存活。
　　當進行空間分析時，49個已識別物種中的36個物種并不普遍，并且在給定的SAF位置僅分離一次?？臻g上最豐富的分離物是枯草芽孢桿菌，在SAF的13個采樣位置中的9個位置發現了枯草芽孢桿菌（圖2a）。當在11個采樣期內對分離物進行時間分析時，大多數物種（30/49，約61%）在給定采樣期內的6個月采樣期內僅分離一次。時間上最豐富的物種是泛熱腸桿菌（Virgibacillus panthonthenticus）（17個分離株）和枯草桿菌（14個分離株，它們在7個單獨的采樣階段從SAF地板上分離出來（圖2a），其次是在6個采樣階段發現的短小芽孢桿菌（14種分離株）。培養的分離物之間的系統發育關系如圖所示。2a， 其中四個分離物代表潛在的新物種，因為它們與任何有效描述的物種的16S rRNA序列具有≤98.7%的序列相似性。在已鑒定的16個屬中，3個屬也在16S rRNA基因Illumina擴增子測序分析中被鑒定，所有樣本的讀數均超過100。在這兩種方法鑒定的3個屬中，一個屬是芽孢形成菌（Bacillus），而另外兩個屬（Massillia和Staphylococcus）是非芽孢形成菌，但耐熱。
　　每個樣本的讀取計數在不同類型的樣本中有所不同（Kruskal-Wallis P<0.0001，KW=93.15），其中PMA未處理的樣本的計數高于PMA處理的樣本（P<0.00001）和對照組（無論處理如何）[PMA-（P<0.001）和PMA+對照組（P<0.001]（圖3a）。微生物豐富度在不同類型的樣品中也存在差異（Kruskal-Wallis P<0.0001，KW=84.31），PMA未處理樣品的豐富度高于PMA處理樣品和對照（P<0.00001）（圖3b）。PMA處理的樣品或對照組之間的豐富度沒有差異。UniFrac未加權（圖3c）和加權（圖3d）分析顯示PMA處理的差異β多樣性。與PMA處理相關的特征（1250個總屬中的180個）的熱圖表示如圖所示，該熱圖表示是使用Calour（一種以微生物為中心的交互式分析工具[53]）中基于等級的差異豐度測量計算的。3e， 顯然PMA處理去除了大部分死亡微生物。當從給定采樣日期和地點的PMA和非PMA樣本中檢測和比較序列時，平均約33%的OTU豐度被確定為來自活細胞或由于加工過程中的背景污染而存在。
　　除了對RPCA產生的Aitchison距離進行PCA外，還通過未加權和加權UniFrac上的PCoA評估16S rRNA基因擴增子測序組成的變化。PMA處理和收集時間點導致了微生物群的顯著差異（圖3f），并導致了解釋的總效應大小的大部分（表S1）。PMA處理導致的β多樣性的這些變化部分歸因于假單胞菌（目）相對于Bacilli（類）的對數比率的降低（圖3g）。使用假單胞菌（順序）與Bacilli（類別）的對數比率來理解微生物多樣性的變化，因為與假單胞菌相關的讀數在采樣環境中沒有增加，而Bacilli讀數在入口與設施內部之間有所增加。
　　為了解釋數據的重復測量結構（即時間），CTF用于探索SAF位置之間的微生物群落變化。CTF而非RPCA、加權或未加權-UniFracβ多樣性距離揭示了SAF房間位置之間的顯著差異（表S2）。房間中的差異部分由根瘤菌（變形桿菌）與芽孢桿菌（厚壁菌）的對數比率來解釋（圖S1a；圖S1b）。隨著設施入口半徑的增加，還觀察到根瘤菌（變形桿菌）與芽孢桿菌（厚壁菌）的對數比率降低。我們進一步假設，鑒于已知的芽孢形成能力，芽孢的彈性可能是SAF房間位置之間觀察到的變化的驅動因素。根瘤菌和芽孢桿菌通常都存在于環境中，因此很容易從外部來源帶入。但根瘤菌是非孢子形成的，在遠離入口的地方很可能是不存活的， 注意并計算了兩者之間比率的變化。
　　使用Deutsche Sammlung von Mikrooorganismers und Zellculturen（DSMZ）BacDive數據庫的祖狀態重建，通過SEPP插入樹預測孢子形成能力（平均精度=0.83；圖S2）。預測的非孢子形成微生物和孢子形成微生物的位置平均對數比率與距SAF設施入口的徑向距離相關（Pearson相關（r=0.61，P=0.027；圖4a），表明與非孢子形成菌相比，孢子形成菌的數量隨著遠離入口而減少。使用AGP和EMP源數據集對每個房間隨時間的微生物源進行跟蹤，揭示了SAF污染細菌的可能來源。隨著入口半徑的增加，動物表面（AGP；皮膚）的貢獻減少，土壤（EMP；非鹽水）來源的貢獻增加（圖4b）。非鹽水表面（EMP） 也有助于作為源環境，但除了在800像素的半徑處的尖峰之外保持穩定。
　　對所比較的所有設施的詳細描述和解釋超出了本報告的范圍，但我們提供了當前時間序列SAF數據與之前的100拭子KatharoSeq JPL-SAF數據、一個新生兒重癥監護室、一個鮑魚飼養設施、，以及三個國際空間站（ISS）環境數據，用于表征一系列低生物量環境并將其相互關聯（圖4c，d）[1]。在五個環境中的每一個環境中，極其清潔的鮑魚養殖設施都表現出與其他設施樓層完全不同的微生物特征。盡管所有其他設施在微生物多樣性方面看起來相似（圖4c）， 加權Unifrac分析的詳細特征表明，與JPL-SAF時間序列樣本相比，新生兒重癥監護室和ISS表面的微生物多樣性組成存在差異。與之前的JPL KatharoSeq研究相比，本次JPL時間序列數據點的微生物群落組成有所不同（圖4d）。
　　在PMA處理的樣品中，所有樣品的總讀數超過100，共鑒定出46個非孢子形成屬和8個孢子形成屬（圖5）。在非對照PMA處理的樣品中，讀數分解為4.28%（NSA孢子形成物）、9.66%（非NSA孢子生成物）和86.05%（非孢子形成物。在PMA處理的樣品中鑒定出的十個最主要的屬是鞘氨醇菌屬、假單胞菌屬、糞桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、偶氮螺旋菌屬、芽孢桿菌屬，Deinococcus屬，不動桿菌和節桿菌屬。在十個最突出的總屬中，只有兩個屬（梭狀芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬）是孢子形成菌。這八個孢子形成屬分別是梭狀芽孢桿菌、芽孢桿菌、放線菌屬、地芽孢桿菌屬、放線酵母屬、多力子菌屬、微孢子菌屬和分枝桿菌屬。
　　芽孢桿菌屬和放線菌屬是PMA樣品中檢測到的唯一兩種NSA孢子形成菌。芽孢桿菌是時間上最頻繁的NSA孢子形成菌，在第2、3、4、5、6、7、10和11次采樣中，其讀數比放線菌多。或者，在PMA樣品中檢測到總共六種非NSA孢子形成物（放線菌、梭狀芽孢桿菌、多力子菌、地芽孢桿菌、微孢子菌、分枝桿菌）。土芽孢桿菌是時間上最豐富的非NSA孢子形成體，在第一次采樣過程中非NSA的孢子形成體讀數最多。在PMA樣品中共檢測到46種非孢子形成物。每個采樣階段最豐富的非孢子屬各不相同；然而，不動桿菌在第二次和第四次采樣中的讀數最多。
　　NSA孢子、非NSA孢子形成物和非孢子形成物的比較沒有顯示出任何一致的微生物種群模式（圖5a）。然而，與非NSA孢子形成劑相比，采樣階段4、6和8的NSA孢子讀數更高。在其他每一次采樣過程中，非NSA孢子讀數都大于NSA孢子的讀數。此外，非孢子形成物的讀數大于NSA孢子和非NSA孢子類別在每個采樣階段的總讀數。圖5b，c中用NSA孢子和非NSA孢子的讀數計算的擴增子測序讀數的熱圖清楚地表明，與孢子相關的讀數在對照組中少于100個讀數（1個現場對照組除外），并且在第8次采樣期間采集樣品時最為豐富。13個地點的活微生物種群（PMA處理的樣品）的空間和時間分布如圖所示。5d。位置#5、7， 和8顯示通過NSA方法可檢測到的孢子的存在高于非NSA孢子。在其他地區發現非NSA孢子形成物的發生率較高，這證實了NSA方法錯過了大多數可能需要其他最佳培養條件才能生長的孢子形成物。此外，不能排除這些孢子形成微生物可能處于營養細胞狀態，并在80°C期間被殺死；NSA方法的15分鐘熱沖擊程序。值得注意的是，與孢子形成者相比，所有這些位置都有更多的非孢子形成成員。
　　芽孢桿菌是空間上最豐富的NSA孢子形成體，其NSA孢子生成體總量最高，位于位置12。地芽孢桿菌是空間上最常見的非NSA孢子形成體，位置1中非NSA的孢子形成體讀數最多。空間上最豐富的非孢子形成體是鞘氨醇菌，位置10的讀數較高（圖5c）。
　　在PMA現場對照中未檢測到NSA孢子形成物。在PMA陰性對照中僅檢測到芽孢桿菌（2個讀數）。對照組中最豐富的非NSA孢子形成物是PMA現場對照中的梭狀芽孢桿菌（136個讀數）和PMA陰性對照中的土芽孢桿菌（6個讀數）。PMA現場對照中最豐富的非孢子形成物是不動桿菌（518個讀數）和PMA陰性對照中的Dorea（370個讀數）（圖5b，c）。
　　如Hendrickson等人（2017）之前所述，通過FACS分析了25個樣本，以估計活微生物的數量。通過FACS鑒定的活細胞被隨機分類到384孔微孔板中，從每個測試樣品中收集317個單獨的細胞（圖6a）。對于這項研究，樣本2016-07-12位置#1被選擇用于單細胞基因組學分析的原理證明，并且是唯一使用所有三種方法（NSA、擴增子測序和單細胞基因組測序）進行分析的樣本。選擇該樣本是因為它位于更靠近潔凈室入口的位置，并且據證明具有更高的活生物負載（每平方米8.8 x 105個活細胞）進行分析。此外，該樣品上的平均孢子數為每平方米表面積35個孢子，091 [23]. 其中一個微板的16S rRNA基因的基因組測序和PCR篩選的組合確定了317個產生的SAG中的78個的分類隸屬關系（圖6b）。在已鑒定的SAG中，72個被鑒定為不動桿菌，3個被鑒定是鞘氨醇單胞菌，2個被鑒定成副球菌，1個被鑒定出銅三菌。通過對另外兩個SAG微板的16S rRNA基因PCR篩選，還發現了其他屬，包括Microvirga和Novosphinglobium。RedoxSensor Green陽性細胞的大小、花期和身份如圖所示。6b。
塵埃粒子計數